对病*的灭活和/或清除能力是评价抗体类生物制品下游生产工艺是否稳健和合格的重要指标之一。ICH、FDA以及CDE的相关指导原则中要求对生产工艺的病*灭活和/或清除能力开展验证研究并要求生产工艺中应包含两种机制上互补且有效的病*灭活和/或清除工艺步骤。
在抗体的下游生产工艺操作单元中，具有病*灭活和/或清除能力的步骤主要包括蛋白A层析、低pH孵育、有机溶剂/去垢剂孵育、阴离子交换层析和病*过滤等。其中低pH孵育和病*过滤是国内申报通常选择的两个工艺步骤，而FDA、EMA等国外申报还需评估层析工艺的病*去除效果。下游工艺不同操作单元中病*灭活和清除的基本考量如下：
01
蛋白A层析
蛋白A层析的病*清除作用机制通常包括两部分，首先是上样过程中的病*流穿，其次是洗脱过程中低pH对病*的灭活。蛋白A层析通常的对数下降值（LRV）在1-4个log之间。蛋白A层析步骤的病*清除率在不同产品或工艺之间变化较大的主要原因是病*与抗体之间存在非特异的相互结合导致共洗脱。当尝试阻断病*与单抗的非特异结合后（如添加TritonX-、尿素或异丙醇等试剂），可显著提高蛋白A层析对病*的清除效果。02
低pH孵育
低pH孵育可造成病*包膜上的蛋白结构、膜结构和衣壳结构的变化，从而使得病*失去其感染能力，是常用的包膜病*灭活步骤，但是对鼠细小病*等无包膜病*则效果不明显。低pH步骤可置于蛋白A层析低pH洗脱步骤之后。影响低pH病*灭活的主要因素包括pH、孵育时间、孵育温度、缓冲体系等，低pH灭活的最差条件是高pH、低温、短时间和低离子强度。当pH较低时（如低于3.6），LRV可稳定处于高水平，而与其他因素基本无关。当pH偏高时（如高于3.8），病*灭活效果与pH以外的其他因素如缓冲液浓度、低pH滴定剂种类、温度等因素密切相关。综合来看，pH值是最主要的影响因素，温度的影响通常会随着孵育时间的延长而降低。由于低pH对抗体类分子往往具有不利影响（如诱导抗体聚集等），所以在该步骤中需要考察孵育pH及孵育时间等条件对抗体质量的影响。03
有机溶剂/去垢剂（SD）灭活
对于某些在低pH环境下不稳定的分子，无法用低pH孵育进行灭活病*，此时则可选择有机溶剂/去垢剂进行病*灭活。常用的有机溶剂/去垢剂包括TNBP、TritonX-和PS80等。有机溶剂/去垢剂可单独或混合使用，其关键工艺参数包括灭活温度和时间等，但同时需要评估添加的有机溶剂/去垢剂对产品稳定性和质量的影响以及残留情况。通常情况下，建议将有机溶剂/去垢剂灭活放在下游纯化的起始步骤，以便后续纯化步骤可以进行有效去除。04
阴离子交换层析（AEX）
抗体纯化中AEX层析通常使用流穿模式，从而使得目标产品穿透而病*、HCP等杂质结合在层析介质上。由于病*与介质往往具有比产品更强的结合能力，因此AEX层析通常在一定的操作条件下可有效而稳定地清除病*。当AEX层析的上样pH为中性或弱碱性且电导率较低时，其LRV可达到4log或以上。影响AEX病*清除的关键工艺参数包括pH值、电导率、样品载量和介质使用周期等。AEX层析的病*去除效果通常与样品中的工艺相关杂质水平呈负相关，例如当样品中残留DNA、HCP含量较低时，AEX的病*清除效果可稳定在较高水平。05
病*过滤
病*过滤是抗体类分子生产过程病*清除的关键步骤，其主要基于尺寸排阻，因此可以对各种类型的病*实现有效清除，而不依赖于它们的物理化学特性。病*过滤LRV通常≥4log且对不影响产品质量，具有良好的有效性和稳健性。影响病*过滤的参数主要包括样品浓度、pH、电导率、聚合物含量、温度、操作压力等。对于病*过滤的操作压力，通常认为在高压下操作是最差情况，低压或减压事件不会影响病*清除效果。但自从年发现减压操作会导致细小病*泄露之后，业界逐渐更新了认知。到目前为止，减压已被证明在不同程度上会影响大多数病*过滤器对细小病*的去除效果，并呈现高度的产品依赖性。主要原因是减压导致过滤流速下降，病*颗粒的扩散效应增加，从而增加了逃逸几率。结语
综上所述，由于抗体类生物制品分子结构和性质的多样性，应根据其产品特性和具体生产工艺选择合适的病*灭活和清除步骤，并对各步骤工艺参数进行考察，从而实现病*的有效灭活和清除。奕安济世的CMC团队具有丰富的项目经验，针对单抗、双抗、融合蛋白等产品的病*去除工艺建立了相应的平台解决策略，工艺开发过程中会充分考虑工艺参数对病*灭活和清除效果的影响，确保下游生产工艺具有稳健的病*灭活和清除能力。关于奕安济世
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